正就读中学的少年迈尔斯（沙梅克·摩尔 Shameik Moore 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬伤，随后身体发生独特的改变。偶然机缘，他目击了蜘蛛侠（克里斯·派恩 Chris Pine 配音）和违法喽罗金并（列维·施瑞博尔 Liev Schreiber 配音）的战斗。为了阻止金并利用时空对撞机打乱世界，蜘蛛侠最终壮烈牺牲。可未过多久，来自平行世界的颓丧的彼德·帕克（杰克·约翰逊 Jake M. Johnson 配音）呈现在迈尔斯面前。为了阻止金并的阴谋，并帮助这个帕克返回自己的世界，他们闯入金并的老巢。在这一过程中，二人遭到章鱼博士和徘徊者的狙击。与此同时，来自其他世界的女蜘蛛侠、阴影蜘蛛侠、蜘猪侠、二次元蜘蛛妹相继呈现。